Тестирование лекарств на биоискусственных тканях. Биоинженер Анна Гуллер о регенеративной медицине, проблеме совместимости имплантата с клетками организма и создании новых лекарств от рака

Что такое тканевая инженерия? Как используются нанотехнологии в проектировании современных имплантатов? В проекте «Мир вещей. Из чего сделано будущее» совместно с Фондом инфраструктурных и образовательных программ (ФИОП) рассказываем о последних открытиях и перспективных достижениях науки о материалах в медицине.

Создание и тестирование новых способов лечения и диагностики заболеваний требует значительных усилий, времени и средств. Необходимым условием прогресса в этой области знания является использование надежных и эффективных инструментов и подходов. Одной из таких методологических находок становится тканевая инженерия.

Тканевая инженерия как инструмент регенеративной медицины

В традиционном понимании тканевая инженерия — это реконструкция живых, функционально активных тканей и органов вне организма путем культивирования клеток на специальных субстратах, называемых скаффолдах (от англ. scaffold — «строительные леса»). Такие ткани и органы, воссозданные искусственно, могут использоваться для замещения утраченных или необратимо поврежденных структур тела человека или животных. В этом случае реконструированная в пробирке ткань имплантируется на место повреждения, срастается с местными тканями, прорастает сосудами и постепенно превращается в собственную ткань организма. Несколько реже в регенеративной медицине применяются скаффолды, не заселенные клетками. Бесклеточные скаффолды тоже могут имплантироваться в нужный участок тела, где они самостоятельно инициируют и поддерживают регенерацию. Поэтому тканевая инженерия прежде всего является инструментом регенеративной медицины.

В целом роль тканеинженерных скаффолдов состоит в замещении и воспроизведении свойств внеклеточного матрикса (ВКМ) тканей. Клетки в тканях и органах существуют не в вакууме: в любых тканях, за исключением крови, они прикрепляются к ВКМ. К числу наиболее известных компонентов ВКМ относятся коллаген, эластин, гиалуроновая кислота и другие. Клетки очень чувствительны к составу и физическим свойствам ВКМ. Например, к жесткости и пространственной организации. Так как клеточный состав различных органов неодинаков, то и ВКМ имеет органную специфичность, проявляющуюся не только в химическом составе, но и в физических характеристиках. Клетки, в свою очередь, умеют распознавать органную принадлежность ВКМ и отвечать на сигналы матрикса изменением фенотипа — своей морфологической и функциональной идентичности. ВКМ устроен очень сложно, и это объясняет, почему так трудно в точности воспроизвести его в виде скаффолдов для тканевой инженерии.

Скаффолды могут быть получены с помощью химических и инженерных методов из синтетических или натуральных веществ. Например, из полимолочной кислоты, из компонентов водорослей или из различных, в том числе рекомбинантных, белков, таких как коллаген. Иногда в составе скаффолдов комбинируются вещества искусственного и натурального происхождения.

Скаффолды, искусственно создаваемые, имеют четко заданный состав и структуру. Это огромное преимущество для воспроизводимого серийного производства, например, с помощью 3D-печати и для решения различных исследовательских задач. Однако клетки достаточно легко распознают обман, если вместо настоящего ВКМ им предлагается подделка. Иммунная система организма тоже расценивает подобные имплантаты как инородные тела и начинает их атаковать. Сила этой иммунной атаки может быть разной, и в результате имплантат может быть частично или полностью разрушен или изолирован от окружающих тканей соединительнотканной капсулой. Низкая иммуногенность в сочетании со способностью скаффолдов поддерживать прикрепление и рост нужных клеток описывается понятием «биосовместимость». Достижение биосовместимости синтетических скаффолдов, а также скаффолдов из натуральных компонентов, созданных искусственно, часто является сложной задачей.

Альтернативный подход к получению скаффолдов основан на использовании не единичного структурного компонента, например какого-то белка, с последующей инженерной трансформацией, а на извлечении и сохранении в максимально натуральном виде естественного ВКМ из тканей животных и человека. Процедура, которая для этого проводится, называется децеллюляризацией (в переводе с латинского «удалять клетки»). Существует множество методик децеллюляризации, но главным отличием высококачественных скаффолдов из децеллюляризированных тканей является очень высокая биосовместимость. Кроме того, с помощью этой процедуры можно получать органоспецифические скаффолды. Это позволяет в дальнейшем выращивать клетки необходимого органа в привычном им ВКМ — например, гепатоциты в ВКМ печени. Интересно также то, что благодаря низкой иммуногенности белков ВКМ для получения таких скаффолдов можно использовать не только фрагменты удаленных при операциях человеческих тканей или трупные ткани человека, но и ткани или органы животного происхождения. Таким образом, органоспецифические скаффолды из децеллюляризированных тканей имеют очень хорошие перспективы применения в регенеративной медицине: они хорошо поддерживают рост клеток, хорошо приживаются на месте имплантации, стимулируют рост сосудов, а также могут задавать направление специализации клеток так, чтобы регенерировала именно та ткань, которая нужна.

Моделирование тканей для исследовательских задач

В течение последних нескольких лет начала формироваться совершенно новая область применения тканеинженерных скаффолдов и реконструированных тканей на их основе. Во-первых, выяснилось, что такие ткани, в отличие от донорских, можно довольно долго поддерживать в жизнеспособном состоянии вне организма, in vitro. Во-вторых, оказалось, что c помощью тканевой инженерии можно создавать не только здоровые, но и больные ткани, например опухоли. Клетки, растущие на скаффолдах, повторяют биологические свойства, закономерности роста тканей и хода заболеваний гораздо более точно, чем это делают клетки, растущие на плоских и жестких пластиковых и стеклянных поверхностях в виде тонких слоев, скажем на чашках Петри. Клетки, растущие в монослое, часто ведут себя аномально из-за пластикового плоского субстрата, нарушенных клеточно-матриксных и клеточно-клеточных взаимоотношений. Поэтому реконструированные ткани могут служить моделями для изучения развития и регенерации органов и механизмов заболеваний. Далее пришло понимание того, что тканеинженерные технологии могут быть использованы для тестирования лекарственных препаратов, медицинских наночастиц и биоматериалов. Такой подход позволит сократить потребность в исследованиях на животных и в то же время обеспечить более биологически точные результаты.

Поиск новых подходов в тестировании лекарств и наночастиц

Одна из самых важных трудностей в тестировании лекарств и наночастиц — это трансляция, то есть переход от исследовательской стадии к клиническому применению. По разным оценкам, около 70–95% потенциальных лекарств против рака, которые показывают положительные результаты на доклиническом этапе тестирования, позже проваливаются в ходе клинических испытаний. Эти провалы чаще всего связаны с неэффективностью лекарства или с его высокой токсичностью. Например, существенная кардиотоксичность может стать препятствием к применению эффективного противоопухолевого препарата.

По оценкам фармацевтических компаний, на создание одного препарата против рака в среднем требуется около 20 лет. Это время затрачивается на поиск молекулярного механизма-мишени и на изучение взаимодействия лекарства-кандидата с клетками, тканями, органами и организмом в целом. Далее проводятся специальные проверки, чтобы определить более точно, при каких формах и стадиях заболевания потенциальный препарат наиболее эффективен и безопасен. После этого происходит селекция пациентов: определяется, каким пациентам этот препарат показан к применению, а каким — нет.

Ранние молекулярно-биологические исследования, которые определяют закономерности на уровне внутриклеточной машинерии, можно производить на клетках. Однако фармакокинетику и фармакодинамику нужно изучать на надклеточных уровнях, что в рамках классической методологии означает переход к тестированию на животных сразу после тестирования на клетках. Однако клетки вне своей собственной среды — ВКМ или заменяющего его высококачественного скаффолда — ведут себя аномально. Чувствительность клеток ко многим воздействиям в монослойной культуре in vitro значительно выше, чем в организме животных, а значит, при переходе к тестам на животных эффект лекарства может исчезнуть. Животные также могут реагировать на введение лекарств и наночастиц иначе, чем люди, в силу видовых физиологических особенностей. Очевидно, что тестирование кандидатов в лекарства требует огромного количества ресурсов.

Поэтому современные фармацевтические компании в испытаниях лекарств все чаще обращаются к стратегии fail early — раннего прогнозирования неудач, чтобы обнаруживать неэффективность или токсичность лекарств еще до перехода к тестам на животных и сократить длительность исследовательского цикла. Одним из подходов к решению этой задачи является анализ больших объемов данных и математическое моделирование. Другой способ — испытания лекарств и наночастиц уже не на клетках, но еще не на животных. Именно здесь на помощь могут прийти технологии экспериментальной тканевой инженерии.

Тканеинженерные технологии

Наиболее известная технология из числа новых методов, которые нужны для обхода ограничений, возникающих при фармакологических и токсикологических исследованиях на классических культурах клеток, — это тестирование на трехмерных культурах клеток, а также на микрофлюидных устройствах, которые называются «органы на чипах». Третий тип — тканеинженерные конструкции на скаффолдах, являющиеся наиболее биологически точными, сложными и продвинутыми 3D-культурами. Их использование только начинается. Тем не менее в этой области сделаны серьезные шаги по адаптации более простых 3D-культур, таких как бесскаффолдные многоклеточные агрегаты — сфероиды и органоиды для задач фармакологии и токсикологии.

Сфероиды — это небольшие (обычно до 500 микрон в диаметре) шарики из слипшихся друг с другом клеток. Считается, что такие агрегаты довольно успешно имитируют небольшие участки опухолей солидной структуры. Например, сфероиды позволяют отследить, как, на какую глубину и с какой скоростью лекарство или наночастицы проникают вглубь ткани. За счет меньшей чувствительности клеток внутри сфероидов к неблагоприятным условиям среды при тестировании токсичных препаратов можно получить более реалистичные данные, чем при проведении испытаний на клетках в 2D-культурах. Органоиды — это более сложная технология, которая позволяет создавать органоспецифические клеточные агрегаты. Принципы применения их такие же, как для сфероидов: тестируемое вещество или наноматериал добавляются в культуральную среду, в которой растут сфероиды или органоиды; затем измеряются биологические ответы — гибель и жизнеспособность клеток, экспрессия генов и другие.

В микрофлюидных чипах клетки определенного органа помещаются в трехмерную среду и подвергаются перфузии через очень тонкие капилляры. В перфузионный раствор могут быть добавлены интересующие исследователя вещества. Таким образом, имитируется поступление лекарства через транспортные системы организма. У данной технологии есть множество преимуществ перед традиционными методами: малый расход реагентов и тестируемых веществ, высокая чувствительность определения компонентов пробы, компактные размеры и низкое энергопотребление. Однако технология тестирования на чипах проигрывает тканевой инженерии в степени воспроизведения биологических свойств ткани.

Для тестирования фармакологических и токсикологических характеристик потенциальных лекарств или наночастиц для медицины на биоискусственных тканях нужно сначала создать подходящий скаффолд. Затем заселить его нужными клетками, учитывая, что в составе каждого органа одновременно присутствуют несколько видов клеток, так же как и в составе болезненных очагов. После того как клетки сформируют тканеподобную структуру, потенциальное лекарство или наночастицы могут быть добавлены в культуральную среду. После заданного времени экспозиции тканеинженерные конструкции переносят в тестовые планшеты и добавляют к ним реактивы, которые позволяют определить, например, сколько живых клеток осталось в культуре после добавления лекарства.

Тестирование наночастиц требует больше сил и средств, чем испытание лекарственных препаратов, так как к свойствам лекарства, загруженного в наночастицы, добавляется целый набор свойств самой частицы, определяющих ее поведение в тканях.

Проблема воспроизводимости результатов в тестировании лекарственных препаратов

Основные преимущества испытаний лекарств на биоискусственных тканях — это сокращение времени тестирования, экономия ресурсов и улучшенная воспроизводимость. Эксперименты на животных имеют определенные ограничения, так как у каждого живого организма есть свои индивидуальные особенности, которые влияют на метаболизм тестируемых лекарств и наночастиц. Кроме того, чем сложнее система, тем меньше у нее воспроизводимость. По этой причине результаты экспериментов, полученных на животных, являются плохо воспроизводимыми, и для подтверждения выводов обычно требуется повторение опытов с большим числом животных. Биоискусственные ткани, тканеинженерные конструкции и трехмерные культуры клеток гораздо более воспроизводимы, поскольку они устроены проще.

Перспективы применения экспериментальной тканевой инженерии

Наряду с регенеративной медициной, фундаментальными исследованиями органогенеза, морфогенеза и патогенеза заболеваний испытание новых лечебных и диагностических агентов на биоискусственных тканях — это очень перспективное направление работы. Важными аспектами этой работы являются создание максимально точных, живых и функционально активных реплик здоровых и больных тканей, адаптация потенциальных лекарств и наночастиц к условиям, специфичным для этих тканей, а также формирование законодательной базы для испытаний.

Для тестирования новых методов лечения, как правило, необходимо моделировать ткань, пораженную заболеванием. Не все патологические процессы пока удается воспроизвести искусственно. Например, воспаление, старение, дегенерацию травмы пока что смоделировать на тканевом уровне весьма сложно. Это системы следующего уровня сложности, в них присутствуют иммунный компонент и кровообращение. Одним из удачных решений является выращивание биоискусственных тканей на микрофлюидных чипах и в различных биореакторах.

Тестирование препаратов на биоискусственных тканях, реконструированных с помощью тканевой инженерии, на сегодняшний день не является стандартной практикой. Фармкомпании проявляют к этой технологии большой интерес, но потребуется время для разработки и введения в практику стандартных живых эквивалентов больных и здоровых тканей и органов. У данной технологии есть хорошие перспективы, однако они зависят от законодательства и запроса общества.